Në procesin e kryerjes së studimeve gjenetike, shpesh hasim mostra të pamjaftueshme të ARN-së, për shembull, për studimin e tumoreve të vogla anatomike të gojës, madje edhe mostra njëqelizore dhe mostra të mutacioneve të gjeneve specifike që transkriptohen në nivele shumë të ulëta në qelizat njerëzore.Natyrisht, për testin për COVID-19, nëse tamponët nuk janë në vendin e duhur ose nuk janë kohë të mjaftueshme gjatë marrjes së mostrave, madhësia e kampionit do të jetë shumë e ulët, për këtë arsye Komisioni i Shëndetësisë dhe Planifikimit Familjar doli dy ditë më parë dhe e ka kaluar testin dhe nëse kampionuesi i acidit nukleik nuk ka marrë gjashtë mostra, ju mund ta raportoni atë.
Ndjeshmëria e reagentit është e rëndësishme sepse kemi këtë apo atë problem, kështu që çfarë mund të bëjmë për të përmirësuar ndjeshmërinë e RT-PCR?
Përpara se të diskutojmë zgjidhjet e mundshme, le të përmendim dy ndërlikime të mëdha me situatën që sapo përmendëm.
Para së gjithash, ne shqetësohemi për humbjen e ARN-së kur kemi vetëm disa popullata qelizore në kampionin tonë.Nëse përdoren metoda tradicionale të ndarjes dhe pastrimit, të tilla si metoda e kolonës ose metoda e precipitimit të acidit nukleik, ka shumë mundësi që ato pak mostra të humbasin.Një zgjidhje është shtimi i një molekule bartëse, siç është tRNA, por edhe atëherë, nuk ka asnjë garanci që eksperimenti ynë i rikuperimit është në rregull.
Pra, cila është një mënyrë më e mirë?Një opsion i mirë për qelizat e kultivuara ose mostrat mikroanatomike është përdorimi i lizës direkte.
Ideja është që të ndahen qelizat për 5 minuta, të lëshohet ARN në tretësirë, pastaj të ndalohet reaksioni për 2 minuta, pastaj të shtohet lizati direkt në reaksionin e transkriptimit të kundërt në mënyrë që të mos humbasë asnjë ARN, dhe në fund të vendoset cDNA që rezulton drejtpërdrejt. në reagimin në kohë reale.
Por, çka nëse, për shkak të një pikënisjeje të kufizuar ose një sasie të vogël të shprehjes së gjenit të synuar, ne mund të riciklojmë të gjithë ARN-në dhe ende të mos ofrojmë modele të mjaftueshme për të marrë një sinjal të mirë në kohë reale?
Në këtë rast, hapi i para-amplifikimit mund të jetë shumë i dobishëm.
Më poshtë është një skemë për të rritur ndjeshmërinë pas transkriptimit të kundërt.Përpara se të fillojmë, ne duhet të pyesim në rrjedhën e poshtme se për cilat objektiva jemi të interesuar, në mënyrë që të hartojmë primerë specifikë për këto objektiva për para-amplifikimin.
Kjo mund të arrihet duke krijuar një abetare të përzier me deri në 100 palë abetare dhe një cikël reagimi prej 10 deri në 14 herë.Prandaj, nevojitet një Master Mix i krijuar posaçërisht për këtë kërkesë për të para-amplifikuar cDNA-në e marrë.
Arsyeja për vendosjen e numrit të cikleve midis 10 dhe 14 është se ky numër i kufizuar ciklesh siguron rastësi midis objektivave të ndryshëm, gjë që është thelbësore për studiuesit që kanë nevojë për informacion sasior molekular.
Pas amplifikimit paraprak, ne mund të marrim një sasi të madhe të cDNA, në mënyrë që ndjeshmëria e zbulimit në pjesën e pasme të përmirësohet shumë, madje mund të hollojmë kampionin dhe të kryejmë reagime të shumta PCR në kohë reale për të eliminuar gabimet e mundshme të rastit.
Koha e postimit: Prill-11-2023